KROMATOGRAFI

Disusun oleh:

M. Evi Nur Hidayat 140210060019

Jurusan Kimia

Kelas A

Kelompok 2

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN KIMIA

LABORATORIUM KIMIA ORGANIK

JATINANGOR

2009

ABSTRAK

Metabolit sekunder merupakan kandungan yang terdapat pada tanaman yang memilki aktivitas tertentu terhadap tubuh manusia. Produk metabolit sekunder setiap tanaman berbeda, tergantung pada spesiesnya. Terpenoid, steroid, flavonoid, poliketida dan alkaloid merupakan contoh dari produk metabolit sekunder. Percobaan ini bertujuan untuk mengekstaksi dan mengisolasi kandungan metabolit sekunder dari daun Theobroma cacao dengan metode kromatografi dan mengidentifikasi kandungan metabolit sekunder dari daun Theobroma cacao dengan metode kromatografi lapis tipis. Daun Theobroma cacao diekstraksi dengan menggunakan methanol, kemudian ekstrak dievaporasi sehingga menghasilkan ekstrak pekat dan ditambahkan silika impact. Kemudian ekstrak dimasukkan ke dalam kolom kromatografi dan dielusi dengan menggunakan pelarut n-heksana dan aseton bergradien. Eluat ditampung dan diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis. Pada plat kromatografi lapis tipis terdapat tiga noda pada fraksi ke 2 yang berarti terdapat tiga senyawa pada fraksi ke 2.

ABSTRACT

Secondary metabolism is a substrate that has certain activity to body which consist on plant. Secondary metabolism products are different for each plant, it depends on the species. Terpenoid, steroid, flavonoid, polyketide, and alkaloid include the secondary metabolism product. The purpose of these experiments are extracting secondary metabolism product from Theobroma cacao leaf, isolating the secondary metabolism product from Theobroma cacao leaf by chromatography method and identifying the secondary metabolism product from Theobroma cacao leaf by thin layer chromatography. Theobroma cacao leaf is extracted by methanol, then the extract is evaporated and yield concentrated extract and then added silica impact. The extract is removed to the column and eluted by mixture of n-hexane and acetone. The eluat is collected and identified by Thin Layer Chromatography (TLC). On the TLC plat, there are three spots in the second fraction and it indicates three compound in second fraction.

KROMATOGRAFI

I. TUJUAN

1. Mengekstraksi ekstrak metabolit sekunder dari daun cokelat (Theobroma cacao).

2. Mengisolasi kandungan metabolit sekunder dari daun cokelat (Theobroma cacao) dengan metode kromatografi kolom

3. Mengidentifikasi kandungan metabolit sekunder dari daun cokelat (Theobroma cacao).

II. PRINSIP

1. Ekstraksi

Pemisahan dua senyawa atau lebih melalui penambahan zat ketiga sebagai pelarut pemisah.

a. Hukum Distribusi Nernst

Jika ke dalam sistem dua campuran sewnyawa di masukkan zat ketiga, zat tersebut akan terdistribusi sedemikian rupa dalam sistem membentuk tetapan distribusi (K_D)

b. Like dissolved like

Suatu senyawa lebih mudah larut dalam pelarut yang memiliki kepolaran relative sama dengan senyawa tersebut.

2. Migrasi Diferensial

Perbedaan kecepatan distribusi komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan koefisien partisi.

3. Distribusi Partisi

Kecepatan gerak komponen-komponen diantara fasa gerak dan fasa diam yang berbeda tingkat kepolarannya.

III. TEORI

Pengujian fitokimia sangat penting dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang terkandung di dalam tumbuhan, bagaimana hubungannya satu sama lain serta kontribusi terhadap tumbuhan itu sendiri. Pengetahuan mengetahui struktur kimia serta hubungannya dalam tumbuhan dapat membantu untuk mengetahui bagaimana cara kerja obat-obatan herbal dalam tubuh manusia. Selain itu dapat juga diperoleh informasi mengenai tumbuhan yang memiliki potensi dengan keaktifan fisiologis tertentu (Duke, 2003)

Penapisan kimia merupakan tahap awal dari pengerjaan secara kimia. Tahap ini memegang peranan penting karena dari hasil penapisan kimia tersebut dapat diketahui golongan senyawa yang terkandung di dalam tumbuhan. Metode yang digunakan harus bersifat sederhana, pengerjaannya cepat, menggunakan peralatan yang minimun, menggunakan reagen yang selektif terhadap suatu golongan senyawa tertentu, memiliki limit deteksi yang rendah dan memberikan informasi tambahan mengenai ada atau tudaknya gugus fungsi tertentu. Hal ini dikarenakan pengerjaan penapisan kimia dilakukan di lapangan dan kadar zat yang dideteksi cukup kecil (Harborne, 1987)

Metabolit sekunder dikenal juga sebagai suatu bahan alam dimana berbagai produknya (senyawa kimia) dari suatu metabolisme tidak esensial untuk pertumbuhan normal, perkembangan, atau reproduksi dari tanaman atau organisme. Dalam hal ini dikenal sebagai produk sekunder.senyawa-senyawa dari metabolit sekunder tidak selalu terdapat pada organisme hidup maupun dihasilkan secara terus-menerus. Kelas utama dari metabolit sekunder adalah alkaloid, terpeniod, alifatik, aromatik, asam organik heteroaromatik, fenol, iridoid, minyak atsiri, resin, balsem ,dan saponin (Achmad, 1986).

Kakao merupakan tumbuhan tahunan (perennial) berbentuk pohon, di alam dapat mencapai ketinggian 10m. Meskipun demikian, dalam pembudidayaan tingginya dibuat tidak lebih dari 5m tetapi dengan tajuk menyamping yang meluas. Hal ini dilakukan untuk memperbanyak cabang produktif.

Bunga kakao, sebagaimana anggota Sterculiaceae lainnya, tumbuh langsung dari batang (cauliflorous). Bunga sempurna berukuran kecil (diameter maksimum 3cm), tunggal, namun nampak terangkai karena sering sejumlah bunga muncul dari satu titik tunas. Bunga kakao tumbuh dari batang.

Penyerbukan bunga dilakukan oleh serangga (terutama lalat kecil (midge) Forcipomyia, semut bersayap, afid, dan beberapa lebah Trigona) yang biasanya terjadi pada malam hari1. Bunga siap diserbuki dalam jangka waktu beberapa hari.

Kakao secara umum adalah tumbuhan menyerbuk silang dan memiliki sistem inkompatibilitas-sendiri (lihat penyerbukan). Walaupun demikian, beberapa varietas kakao mampu melakukan penyerbukan sendiri dan menghasilkan jenis komoditi dengan nilai jual yang lebih tinggi.

Buah tumbuh dari bunga yang diserbuki. Ukuran buah jauh lebih besar dari bunganya, dan berbentuk bulat hingga memanjang. Buah terdiri dari 5 daun buah dan memiliki ruang dan di dalamnya terdapat biji. Warna buah berubah-ubah. Sewaktu muda berwarna hijau hingga ungu. Apabila masak kulit luar buah biasanya berwarna kuning.

Biji terangkai pada plasenta yang tumbuh dari pangkal buah, di bagian dalam. Biji dilindungi oleh salut biji (aril) lunak berwarna putih. Dalam istilah pertanian disebut pulp. Endospermia biji mengandung lemak dengan kadar yang cukup tinggi. Dalam pengolahan pascapanen, pulp difermentasi selama tiga hari lalu biji dikeringkan di bawah sinar matahari (Brenda, 2009)

Taksonomi dari tanaman kakao :

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Malvales

Famili : Malvaceae (Sterculiaceae )

Genus : Theobroma

Spesies : Theobroma Cacao (Brenda,2009)

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.

Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi berkelanjutan diperlukan apabila padatan hanya sedikit larut dalam pelarut. Namun sering juga digunakan pada padatan yang larut karena efektivitasnya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah:

* Tipe persiapan sampel

* Waktu ekstraksi

* Kuantitas pelarut

* Suhu pelarut

* Tipe pelarut (Sudjadi, 1988) Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Istilah kromatografi diambil dari bahasa Yunani yang berarti warna, chromanos. Tswett menemukan teknik ini tahun 1903 pada waktu studinya yang dipusatkan pada pemisahan campuran dari pigmen tanaman. Daerah kromatografi dideteksi sederhana dengan mengamati berkas warna (Mayo et al., 1994).

Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fase diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Ada beberapa mekanisme untuk perbedaan migrasi (Sudjadi, 1988).

Berikut ini beberapa contoh macam-macam kromatografi kolom konvensional, yaitu (Sudjadi, 1988):

1. Kromatografi Penukar Ion.

Sistem ini digunakan khusus untuk spesi ion. Contohnya pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino.

2. Kromatografi Filtrasi gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.

3. Kromatografi Adsorpsi

Merupakan jenis kromatografi yang menggunakan fasa diam yang mengadsopsi sampel berdasarkan kepolaran. Fasa diam yang biasa digunakan dalam kromatografi adsorpsi adalah silika gel.

Dalam kromatografi, fasa diam yang sering digunakan adalah silika gel. Silika gel merpakan suatu bentuk dari silika yang dihasilkan melalui penggumpalan sol natrium silikat (NaSiO₂). Sol mirip agar - agar ini dapat didehidrasi sehingga berubah menjadi padatan atau butiran mirip kaca yang bersifat tidak elastis. Sifat ini menjadikan silika gel ndimanfaatkan sebagai zat penyerap, pengering dan penopang katalis. Garam - garam kobalt dapat diabsorpsi oleh gel ini.

Silika gel mencegah terbentuknya kelembaban yang berlebihan sebelum terjadi. Para pabrikan mengetahui hal ini, karena itu mereka selalu memakai silika gel dalam setiap pengiriman barang-barang mereka yang disimpan dalam kotak. Silika gel merupakan produk yang aman digunakan untuk menjaga kelembaban makanan, obat-obatan, bahan sensitif, elektronik dan film sekalipun. Jangan terlalu mengartikan gel dalam pengertian suatu produk yang bentuknya gel ataupun silicon gel. Produk anti lembab ini menyerap lembab tanpa merubah kondisi zatnya. Walaupun dipegang, butiran-butiran silica gel ini tetap kering.
Silika gel penyerap kandungan air bisa diaktifkan sesuai kebutuhan. Unit ini mempunyai indikator khusus yang akan berubah dari warna biru ke merah muda kalau produk mulai mengalami kejenuhan kelembaban. Saat itulah alat ini aktif. Setelah udara mengalami kejenuhan/kelembaban, dia bisa diaktifkan kembali lewat oven. Sejak Perang Dunia II, silika gel sudah menjadi pilihan yang terpercaya oleh pemerintah dan pelaku industri (Antoni, 2009).

Kromatografi lapis tipis adalah serupa dengan kromatografi kertas kecuali kertas diganti dengan lempeng gelas atau aluminium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi (Sudjadi, 1988).

Kromatografi lapis tipis, fase diamnya merupakan adsorben seperti silika gel yang diratakan di atas plat tipis seperti plat kaca. Kromatografi lapis tipis dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama dipakai sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif dan preparatif. Kedua dipakai untuk mengajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom (Mc Murry & Fay, 2004).

IV. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

1.	Chamber	11.	Plat KLT
2.	Evaporator	12.	Spatula
3.	Gunting	13.	Statif dan klem
4.	Kapas	14.	Tabung evaporasi
5.	Kolom	15.	Tabung reaksi
6.	Label
7.	Mortir dan stemper
8.	Pipa kapiler
9.	Pipet mikro
10.	Pipet pasteur

2. Bahan Kimia

1.	Aseton
2.	Daun Theobroma cacao
3.	n-heksana
4.	Metanol
5.	Silika gel

3. Gambar Alat

Gambar 1. Kolom Kromatografi Gambar 2. Chamber

V. PROSEDUR

1. Ekstraksi

Sebanyak 3- 5 gram sampel berupa daun cokelat dipotong kecil-kecil dan dihaluskan dengan mortir kemudian setelah halus, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, setelah itu sample yang berada di dalam tabung reaksi di ekstraksi dengan metanol dan dipanaskan selama 10 menit, setelah diekstraksi, sample yang telah terekstrak di saring dengan kapas. Residu yang terbentuk dibuang, lalu ekstrak ditempatkan pada tabung evaporasi. Kemudian dievaporasi sampai terbentuk ekstrak pekat. Ke dalam ekstrak pekat tersebut ditambahkan silika impact dan diaduk-aduk sampai semua ekstrak pekat berubah menjadi padatan.

2. Kromatografi

Silika gel ditimbang sebanyak satu gram kemudian dikembangkan dengan 10 mL n-heksana. Kapas dimasukkan ke dalam kolom, kemudian n-heksan dialirkan ke dalam kolom dan keran ditutup. Silika gel yang telah dikembangkan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom. Laju alir diatur sehingga lajunya menjadi 3 detik per tetes. Setelah itu, ekstrak padat dimasukkan ke dalam kolom dan kemudian dielusi dengan menggunakan pelarut n-heksana : aseton (100 mL : 0mL) sebanyak 5 mL. Fraksi pertama ditampung. Setelah pelarut yang pertama hampir mendekati silika gel, pelarut n-heksana : aseton (80 mL : 20 mL) sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom. Begitu seterusnya untuk pelarut n-heksana : aseton (60 ml : 40 mL; 40 mL : 60 mL; 20 mL : 80 mL; 0 mL : 100 mL) sebanyak 5 mL.

2. Kromatografi Lapis Tipis

Sebanyak 5 mL pelarut n-heksana : aseton (40 mL : 60 mL) dimasukkan ke dalam chamber. Plat KLT ditandai tanda batas atas 0,3 cm dan batas bawah 0,5 cm. Kemudian fraksi-fraksi yang didapat dari hasil kromatografi di atas diambil cuplikannya dan ditotolkan pada plat KLT. Kemudian plat KLT ditempatkan ke dalam chamber. Plat KLT dibiarkan sampai pelarut menyentuh batas atas. Kemudian plat dikeringkan. Plat KLT dimasukkan ke dalam lampu UV dan dilihat nodanya. Kemudian disemprot dengan reagen penyemprot H₂SO₄ dalam metanol dan dipanaskan dalam hot plate dan dilihat bercak nodanya.

VI. DATA PENGAMATAN

1. Sifat Fisik dan Kimia Zat

Zat	Sifat Fisika	Sifat Kimia
Aseton	- Tf = -45,70C	- volatil
(CH3)2CO	- Tb = 560C	- mudah terbakar
	- mr = 58 g/mol	- larut dalam etanol
	- ρ = 2,0	- polar
	- cairan bening
Heksana	- Tb­ = 690C	- inert
C6H14	- Tf = -95,60C	- non polar
	- mr = 86 g/mol	- tidak larut dalam air
	- cairan bening
Silika gel	- penyerap yang baik	- tidak beracun
SiO2	- regenerasi pada 1500-2000C	- sangat higroskopis
	- porositas 800 m2/g	- tidak mudah terbakar
	- serbuk putih	- polar

1. Data Pengamatan

Zat	Perlakuan	Hasil
Daun	- Dipotong kecil-kecil lalu dihaluskan	- 2mg daun
	- Ditambahkan metanol lalu dipanaskan selama 10 menit	- Larutan berwarna hijau tua
	- Ekstraknya dievaporasi	- Ekstrak pekat
	- Ditambahkan silika gel	- Ekstrak kering
	- Ditambahkan 100μL metanol
Ekstrak	- Dimasukkan ke dalam kolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan eluen ada 6 fraksi heksana:aseton, yaitu : 1. 100:0 2. 80:20 3. 60:40 4. 40:60 5. 20:80 6. 0:100	- Didapatkan 6 fraksi eluat dengan warna yang berbeda, yaitu : 1. fraksi 1 : kuning 2. fraksi 2 : hijau 3. fraksi 3 : hijau tua 4. fraksi 4 : hijau muda 5. fraksi 5 : bening 6. fraksi 6 : bening
Fraksi	- Ditotolkan pada plat KLT, lalu dielusi dengan pelarut heksana:aseton (60:40)	- Ada pergeseran dan dihasilkan bercak noda
Plat KLT	- Disinari dengan sinar UV 356nm (warna biru)	- Pada fraksi 2 terdapat tiga noda
	- Disinari dengan sinar UV 256nm (warna hijau)	- Tidak ada noda
	- Disemprot dengan 10% H2SO4 dalam metanol lalu dipanaskan	- Tidak terjadi perubahan

VII. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini, dilakukan ekstraksi dan isolasi kandungan metabolit sekunder dari daun cokelat (Theobroma cacao) dengan metode kromatografi kolom dan mengidentifikasi kandungan metabolit sekunder dari daun cokelat (Theobroma cacao) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

Langkah pertama yang dilakukan adalah memotong kecil-kecil daun Theobroma cacao, kemudian ditumbuk untuk memecah dinding sel dari daun Theobroma cacao. Hal ini dilakukan karena kandungan metabolit sekunder yang akan diisolasi terdapat di dalam sel. Oleh karena itu, untuk menarik atau mengambil kandungan metabolit sekundernya kita harus memecah dinding selnya. Setelah itu, daun Theobroma cacao yang telah ditumbuk, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan methanol dengan perbandingan tinggi daun dan methanol 1:1. Penambahan metanol ini dimaksudkan untuk menarik kandungan metabolit sekunder karena metanol bersifat relatif polar dan metabolit sekunder bersifat relatif polar. Setelah itu, ekstrak dipisahkan dengan cara dipipet menggunakan pipet pasteur. Setelah itu, ekstrak dimasukkan ke dalam tabung evaporasi untuk menghilangkan metanol sehingga diperoleh ekstrak pekat yang bebas dari metanol. Ekstrak pekat tersebut kemudian ditambahkan silika impract untuk mengikat ekstrak pekat agar semua ekstrak yang menempel di dinding tabung dapat terambil sehingga didapat ekstrak dalam bentuk padat.

Kemudian, akstrak padat tersebut dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Sebelum dimasukkan, kolom harus dalam keadaan siap pakai. Penyiapan kolom dapat dilakukan dengan mengembangkan silika gel sebagai fasa diam di luar kolom dengan menggunakan pelarut n-heksana. Silika gel merupakan penyerap yang paling banyak dipakai dan dapat dianggap sebagai penyerap yang paling serbaguna. Silika gel dapat dipakai semua pelarut, tetapi ia menunjukkan kemampuan berikatan hidrogen dengan beberapa linarut dan pelarut jika ada air.

Dalam menyiapkan kolom, dimasukkan ke dalamnya kapas agar silika gel tidak keluar kolom sehingga silika gel dapat berinteraksi dengan baik dengan sampel. Silika gel yang telah dikembangkan, dituangkan ke dalam kolom yang telah terisi n-heksana beberapa mililiterdi dalam kolom. Penuangan silika gel dan n-heksana harus merata dan melalui dinding kolom supaya homogen dan posisi kolom harus tegak lurus agar pemisahan dapat optimal. Dalam percobaan, keran dibagian kolom harus tetap mengalir (paling bagus 3 detik per tetes). Hal ini dimaksudkan agar hasil eluat yang didapat baik dan memberikan kesempatan pada silika gel untuk menyerap sampel. Apabila terlalu cepat, maka sampel tidak akan terikat satu sama lain dengan silika gel dan akan terbawa oleh arus eluen keluar kolom.

Ekstrak padat dimasukkan ke dalam kolom pada saat n-heksana sudah mendekati silika gel. Segera setelah ekstrak dimsukkan ke dalam kolom, fraksi (eluen) pertama yang berisi 5 mL n-heksana dimasukkan secara merata ke dinding kolom agar ekstrak padat tidak menempel di dinding kolom. Sampel akan berdistribusi secara teratur melalui permukaan silika gel. Proses yang terjadi adalah adsorpsi yakni penyerapan suatu zat pada permukaan zat lain sehingga eluen dapat membawa sampel yang tidak terserap oleh silika gel akan keluar terelusi keluar kolom. Eluen yang digunakan untuk mengelusi adalah campuran n-heksana dan aseton dengan perbandingan 1:0 ; 8:2 ; 6:4 ; 4:6 ; 2:8 ; dan 0:1. Hal ini dilakukan agar metabolit sekunder yang bersifat nonpolar dan polar akan terpisah. Metabolit sekunder yang yang bersifat polar akan diserap oleh silika gel sedangkan metabolit sekunder yang bersifat nonpolar akan terelusi oleh eluen yang bersifat nonpolar. Oleh karena itu digunakan pelarut bergradien dengan kenaikan 20%.

Sampel (ekstrak padat) harus bebas dari metanol karena akan menggangu proses pemisahan. Metanol bersipat polar sedangkan pelarut (eluen) n-heksan yang digunakan bersifat nonpolar sehingga tidak akan bercampur. Metanol memiliki momen dipol yang diakibatkan oleh perbedaan keelektonegatifan antara atom O dengan atom C dan H sehingga momen dipolnya tidak nol, sedangkan n-heksana tidak memiliki momen dipol karena tiadak ada perbedaan elektronegatifitas antar atom C-nya.

Urutan pelarut berdasarkan kepolarannya dari yang kurang polar ke yang paling polar :

1. n-heksana

2. sikloheksana

3. karbontetraklorida

4. benzena

5. toluena

6. dietil eter

7. kloroform

8. etil asetat

9. asetat

10. etanol

11. metanol.

Kemudian, dari setiap penambahan eluen yang berbeda ditampung fraksi-fraksinya. Setelah didapatkan fraksi-fraksi dari proses kromatografi dengan pelarut bergradien, fraksi-fraksi tersebut kemudian diidentifikasi dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis untuk mengetahui ada berapa senyawa yang terdapat dalam fraksi tersebut.

Pada percobaan lapis tipis, hal pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan pelarut. Pelarut yang digunakan pada percobaan ini adalah campuran n-heksana dan aseton dengan perbandingan 4:6 sebanyak 5 mL. Hal ini dikarenakan prinsip ”like dissolved like” yaitu senyawa akan cenderung mudah larut pada pelarut yang memilki kepolaran yang relatif sama, yang menyebabkan pelarut harus sesuai dengan sampel yang akan diidentifikasi.

Pelarut yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam bejana (Chamber). Setelah itu tutup bejana hingga larutan menjadi jenuh. Pelarut dijenuhkan agar proses elusi berjalan dengan baik. Penjenuhan pelarut juga dimaksudkan untuk memperkecil penguapan pelarut dan akan menghasilkan bercak (noda) yang lebih baik.

Fraksi-fraksi dari kromatografi kolom kemudian masing-masing ditotolkan pada sebuah plat. Sebelumnya plat diberi batas atas dan batas bawah, sesuai prosedur menggunakan pensil karena dalam pensil terdapat karbon (grafit) yang inert sehingga tidak mempengaruhi hasil kromatografi. Penotolan harus tegak lurus agar didapat spot atau noda yang baik. Plat kemudian dimasukkan ke dalam bejana. Tinggi pelarut di dalam bejana harus di bawah tempet penotolan pada plat. Bejana ditutup dan pelarut dibiarkan merambat naik sampai kira-kira mencapai batas atas pada plat. Dalam percobaan kromatografi lapis tipis, fase diamnya menggunakan silika gel yang ditempelkan pada plat aluminium.

Senyawa nonpolar akan bergerak lebih cepat daripada yang polar menurut prinsip ”lile dissolved like”. Pelarut yang nonpolar akan mengikat sampel yang kepolarannya relatif sama bergerak ke atas kerena adanya gaya kapilaritas yang arahnya tegak lurus terhadap pelarut.

Setelah mencapai batas atas, plat diangkat dan dikeringkan. Kemudian dilihat dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 356 nm. Pada plat tampak noda berwarna hijau, hijau tua dan kuning pada fraksi 2. hal ini disebabkan karena di dalam senyawa tersebut terdapat gugus kromofor yang akan menyerap panjang gelombang tertentu dan memancarkan sinar tampak. Kromofor berfungsi sebagai antena, alat penangkap gelombang elektomagnetik pada panjang gelombang tertentu. Suatu panjang gelombang tertentu merangsang perubahan struktur molekul kromofor karema molekul tersebut tereksitasi. Perubahan struktur ini mengakibatkan pelepasan energi / elektron. Energi atau elektron ini lalu ditangkap oleh sistem pembawa signal yang pada akhirnya noda dapat terlihat.

Untuk melihat noda yang tidak mengandung gugus kromofor, maka dilakukan penyemprotan dengan menggunakan reagen penyemprot H2SO4 dalam metanol kemudian dipanaskan dalam hot plate. Tetapi tidak terdapat noda setelah pemanasan.

VIII. KESIMPULAN

1. Kandungan metabolit sekunder dari daun Theobroma cacao dapat diekstraksi.

2. Kandungan metabolit sekunder dari daun Theobroma cacao dapat diisolasi menggunakan metode kromatografi

3. Kandungan metabolit sekunder dari daun Theobroma cacao dapat diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis.

DAFTAR PUSTAKA

Achmad, S.A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Karnunika. Jakarta.

Antoni, K. 2009. Silika Gel. http://www.iptek.net.id/ind/silika gel.

Brenda, J. 2009. Theobroma cacao. http://www.biotech.org/en/theobroma cacao.

Duke, J.A. 2003. Phytochemical and Ethnobotanical Databases. Agricultural Research Service. [Online Database] National Germplasm Resources Laboratory. Beltsville, Maryland. (http://www.ars-grin.gov/duke).

Gritter, G.D. 1994. Analytical Chemistry. John Willey and Sons, Inc. New York.

Harborne, J., 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Cetakan kedua, diterjemahkan oleh Padmawinata, K. dan I. Soediro. Penerbit ITB. Bandung.

Mayo, D. W., Pike, R.M, & Trumper, P.K. 1994. Microscale Organic Laboratory with Multistep and Multiscale Synthesize. Third Edition. John Willey and Sons, Inc. New York.

McMurry, J. & R.C. Fay. 2004. McMurry Fay Chemistry. 4th edition. Pearson Education International. Belmont, CA.

Sudjadi. 1988. Metode Pemisahan. UGM. Yogyakarta.